Sage Science BluePippin

BluePippin — система препаративного электрофореза и пульс — электрофореза, позволяет разделять и выделять фрагменты НК, размером 90–50000 п. н. , а так же белки массой 18–200 кДа.

В системе используются готовые картриджи на пять изолированных капилляров, заполненных агарозным гелем разной процентной концентрации, которая выбирается пользователем в зависимости от величины фрагмента образца. В конце каждого капилляра имеется Y — образное разветвление. Оба выходящих капилляра имеют независимое подключение к катодам. Движение фрагментов ДНК в капилляре как и в «классической» методике происходит под действием тока, но при приближении фрагментов ДНК требуемого размера к месту разветвления, происходит переключение катодов, и искомый фрагмент попадает в боковое ответвление капилляра и собирается в канале для сборки. Для проведения электрофореза нуклеиновых кислот используется Tris — TAPS (или Трис — ТАПС) буфер, для белков — SDS — буфер. Программное обеспечение определяет время элюирования на основе миграции ДНК — маркера.

Преимущества

• Время подготовки — 3 минуты, время проведения самой процедуры — 50–100 мин в зависимости от размеров фрагментов;
• Благодаря готовым гелевым чипам достигается максимальная воспроизводимость экстракции и, как следствие, более точный результат секвенирования;
• Каналы, в которых идёт разгонка, полностью изолированы друг от друга, что снижает риск перекрёстной контаминации;
• Отбор осуществляется, автоматически в соответствии с заданным через ПО диапазоном длин фрагментов, что может использоваться для секвенирования спаренных концов;
• Отбор образцов из пробоотборной камеры производится вручную с помощью стандартного дозатора.

4 режима программирования

1. Tight (узкий) – сбор коротких фрагментов образца, выбирается в основном для работы с молекулами небольших размеров;
2. Range (диапазон) – пользователь может сам выбрать диапазон размера фракций который ему необходим. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования;
3. Time (время) – коллекционирование образцов происходит в зависимости от заданного времени. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования;
4. Peak (пик) – сбор пиков (нескольких фрагментов разного размера).

3 стратегии детектирования фракций

• Для ДНК малых размеров (90 п. н. -1, 5 тыс. п. н. ): Стратегия без окрашивания с внутренними флуоресцентно — мечеными маркерами. В качестве внутренних стандартов используются флуоресцентно — меченые маркеры ДНК, определенной молекулярной массы. Добавляются в лунку совместно с исследуемым образцом. Одновременно возможен анализ 5 образцов.
• Для ДНК больших размеров (> 2 тыс. п. н. ): Стратегия без окрашивания с внешним флуоресцентно — меченым маркером. В качестве внешнего стандарта используется флуоресцентно — меченый маркер ДНК определённой молекулярной массы, добавляется в отдельную лунку. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.
• Для выделения ДНК с дорожки (band capture) (> 2 тыс. п. н. ): Окрашивание образцов флуоресцентным красителем Midori Green. Образцы окрашиваются флуоресцентным красителем Midori Green. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.